Методы генной инженерии

К началу 70-х годов прошлого столетия были изучены основные генетические системы. Была сформулирована так называемая «центральная догма», согласно которой генетическая информация передается от ДНК к РНК и далее к белку, что создало основу для определения генотипа и фенотипа организма на молекулярном уровне. Был идентифицирован основной посредник при переносе информации от ДНК к белку — мРНК (матричная или информационная РНК), расшифрован генетический код и получена информация об основных механизмах трансляции мРНК в белок. Расшифровка генетического кода позволила также разрешить вопрос о природе мутации. Кроме того, были получены первые сведения о регуляции процессов транскрипции и трансляции в различных клетках.

Одновременно с этими выдающимися открытиями было идентифицировано несколько классов ферментов, субстратами которых являются молекулы ДНК и РНК, что в значительной мере облегчило анализ структуры и функций нуклеиновых кислот, а применение их дальнейших исследованиях привело к созданию новой области биотехнологии – технологии рекомбинантных ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала из одного организма в другой. Организмы, полученные при помощи генно-инженерных манипуляций, называют трансгенными или генетически модифицированными.

Генную инженерию можно также определить как конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или как создание искусственных генетических программ.

Прикладная генная инженерия имеет задачу конструировать рекомбинантные ДНК, которые могли бы придать клеткам-реципиентам полезные для человека свойства, например, способность синтезировать вещества, необходимые для медицины и ветеринарии (диагностические препараты, вакцины, гормоны, инсулин, соматотропин, иммунокорригирующие вещества, интерферон, белки крови, урокиназу, α-антитрипсин, гаптоглобин и др.), синтезировать пищевой и кормовой белок, утилизировать ксенобиотики (пестициды, гербициды и др.).

Историю развития генной инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами и фагами, иначе говоря, конструированием так называемых векторных молекул.

На этом этапе были доказаны:

а) возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК от различных видов и штаммов бактерий;

б) их жизнеспособность;

в) стабильность;

г) функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинатных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап связан с началом работ по включению в векторные молекулы ДНК генов эукариот, главным образом, растений и животных.

Формально датой рождения генной инженерии следует считать 1972 г., когда Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, состоявшую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага λ dygal с галактозным опероном Е. coli.

Инструментами молекулярного манипулирования стали прежде всего, два типа ферментов — рестриктирующие эндонуклеазы и лигазы. Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые — для их соединения.

Первая рестриктаза была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем, а наиболее широко применяемая в настоящее время рестриктаза EcoRl получена в 1971 г. Простые методы электрофоретического разделения в гелях позволяют рассортировать смесь фрагментов ДНК, образованных действием рестриктазы, по их длине и таким образом получить химически однородный материал.

Ферменты, которые в настоящее время применяются для конструирования рекомбинантных ДНК, можно разделить на следующие группы:

Ферменты, осуществляющие фрагментацию ДНК. К этой группе относятся рестриктирующие эндонуклеазы: ферменты, узнающие и расщепляющие определенные последовательности в ДНК. Для каждого конкретного фермента эти последовательности отличаются по длине и первичной структуре. Список рестриктаз постоянно расширяется, известно более 85 участков последовательностей, узнаваемых рестриктазами.

Фермент, синтезирующий фрагменты ДНК на матрице РНК: РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза).

Ферменты, сшивающие фрагменты ДНК: ДНК-лигаза (полинуклеотидлигаза) бактериофага Т4 и ДНК-лигаза Е. coli.

Ферменты, позволяющие осуществлять изменение структуры концов фрагментов ДНК: нуклеаза Bal 31 из Alteromonas espejiana, кзонуклеаза III E.coli, нуклеаза S, из Aspergillus oryzae, нуклеаза из манговых бобов, щелочная фосфатаза E.coli из кишечника теленка, полинуклеотидилтрансфераза из тимуса теленка, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, ДНК-полимераза фага Т4.

Ферменты, применяемые для приготовления гибридизационных проб: ДНК-полимераза I E.coli, ДНК-полимераза фага Т4.

Важное значение имеют успехи химии нуклеиновых кислот и, прежде всего, секвенирование ДНК, т.е. определение последовательности нуклеотидов и ее молекулах. Одно только применение рестриктаз позволяет; получить ориентировочные физические карты молекул ДНК, но секвенирование даёт исследователю структуру с предельным разрешением в один нуклеотид. А именно это необходимо для современного уровня молекулярного генетического конструирования.

Методы секвенирования, разработанные Сэнгером и Максэмом-Гилбертом, стали обязательным элементом генной инженерии.

Накопление аналитических данных по строению генома идет так стремительно, что требует использования ЭВМ. Впрочем, последние необходимы не только для накопления банка данных, но также как инструмент исследования способа записи в геноме регуляторных сигналов.

Следующий вклад химии нуклеиновых кислот в генную инженерию — это способы химического и химико-энзиматического синтеза дезоксиполинуклеотидов. Основы этого синтеза были созданы еще Г.Кораной, когда он в 1979 г. синтезировал 207-звенный дезоксиполинуклеотид — ген тирозиновой супрессорной РНК. Т.к. большинство генов эукариот имеют мозаичную структуру, то в данный момент они не могут быть прямым образом использованы, кроме того, способы химического синтеза становятся все более эффективными.

Основным объектом манипуляций генной инженерии служат гены, т.е. фрагменты ДНК, являющиеся функциональной единицей наследственности, кодирующей (как правило) определенный белок.

С молекулярной точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, транскрибируемую в РНК.

Подавляющее большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют так называемые структурные гены, на которых синтезируется мРНК. Остальные кодирующие последовательности приходятся на долю тРНК (транспортной) и рРНК (рибосомальной).

У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. Транскрипция начинается со связывания РНК-полимеразы с промотором, и далее последовательно копируется весь структурный ген с образованием функциональной мРНК.

В бактериальном геноме гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине молекулы ДНК, а в некоторых случаях даже перекрываются. Гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, или ферменты, активности которых так или иначе связаны между собой, часто образуют опероны. Обычно оперон находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется единственная молекула мРНК, кодирующая несколько белков. При транслации такой мРНК, в которой стоп-кодов предыдущего гена соседствует со старт-кодоном последующего, синтезируется набор отдельных белков.

Белок-кодирующие последовательности ДНК у эукариот прерываются некодирующими участками ДНК (рис.2.1б). Некодирующие сегменты называются интронами, а кодирующие участки генов – экзонами. После завершения транскрипции интроны удаляются из первичного транскрипта, а экзоны сшиваются друг с другом.Этот процесс получил название сплайсинга.

Эукариотические мРНК содержат на своем 3 конце «хвост» из 100-200 последовательно присоединенных остатков аденозина так называемый, роlуA-хвост. Кроме того, на 5 конце молекулы мРНК присутствует «кэп», представляющий собой остаток 7-метилгуанозина, присоединенный при помощи необычной трифосфатной связи. У прокариотических мРНК данные элементы отсутствуют.

Гены получают одним из трех способов: непосредственным выделением из природного источника, получением дезоксиполинуклеотидных реплик (кДНК) путем копирования мРНК и химическим синтезом.

Ген в большинстве случаев содержит только последовательность, необходимую для синтеза полипептидной цепи, но не имеет системы сигналов, управляющей его действием в клетке. Так что систему исследователь создает в виде вектора — циклической дезоксиполинуклеотидной молекулы, содержащей сигналы репликации и транскрипции. Сочетание генов и векторов дает рекомбинантную молекулу ДНК.

Векторы — предмет особенного внимания исследователей; их создано множество, с учетом целого ряда специальных требований.

Однако, если операции с ДНК in vitro не подвержены видовым ограничениям, то in vivo, при репликации и транскрипции рекомбинантных ДНК, эти ограничения действуют. И поэтому свойства вектора необходимо подгонять к особенностям клетки, в которую введена рекомбинантная молекула ДНК.

Вектор содержит генетические маркеры, по которым ведут селекцию генетически модифицированных клеток. Чаще всего в прокариотеческих системах — это гены устойчивости к антибиотикам (ампициллину, тетрациклину и др.).

Особенно успешными можно считать исследования по клонированию рекомбинантных ДНК в клетках хорошо изученных организмов. Наряду с E.coli, это B.subtilis. Разработаны методы клонирования в S. cerevisiae, сконструированы челночные векторы, содержащие дрожжевой селективный маркер.

Клетка-хозяин пока единственная среда, в которой может функционировать рекомбинантная молекула ДНК как искусственная генетическая программа.

После введения в реципиентную клетку рекомбинантные ДНК становятся составной частью ее генетического аппарата и придают ей новые генетические и, следовательно, физиологические и биохимические свойства.

Процесс конструирования рекомбинантных ДНК предполагает существование следующих представлений и методических приемов:

четких представлений о молекулярных структурах и механизмах функционирования генов, подлежащих клонированию;

способов выделения этих генов из живых объектов или их химического синтеза;

методических возможностей сшить нужные гены в определенной последовательности с выполнением правил, обеспечивающих эффективную экспрессию (транскрипцию и трансляцию);

методов введения рекомбинантных ДНК в реципиентный организм и создания таких условий, при которых рекомбинантная ДНК стабильно сохранялась бы и функционировала в организме продолжительное время.

Процесс переноса генов проводится по следующей схеме и включает пять основных этапов:

1. Получение фрагментов ДНК (генов).

2. Создание рекомбинантной генетической конструкции. На этом этапе производится встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор). Для выделения, анализа и конструирования генов используют клетки прокариот.

3. Введение ДНК в клетку-хозяина. Получившуюся молекулу рекомбинантной ДНК вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется (размножается) либо самостоятельно, либо интегрируется в хромосому и передается потомкам.

4. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Производится на селективной среде, на которой могут вырасти только трансформированные клетки.

5. Анализ экспрессии (встраивания) перенесенного гена в ДНК клетку-хозяина. Получение специфического белкового продукта, синтезирующегося клетками-хозяевами, служит подтверждением их трансгенной природы.

С момента введения рекомбинантной ДНК в клетку начинается молекулярное клонирование, т.е. получение потомков созданной рекомбинантной ДНК.

Ни один метод перенесения ДНК в клетку не может обеспечить 100% попадания. Часть клеток оказывается трансформированными, часть получает вектор без вставки. Для первичного отбора трансформированных клеток применяют различные селективные гены, детерминирующие какие-либо отличительные фенотипические особенности: возможность детоксикации антибиотика, утилизации определенного субстрата или роста на обедненных средах. По возможности роста на селективной среде производится отбор клеток, получивших векторную ДНК. Далее проводится отделение нужных клонов (клон-группа генетически однородных клеток, образовавшихся в результате деления одной клетки). Анализ может базироваться на определении самого перенесенного гена, либо быть связанным с его функцией (продуктом экспрессии гена).

Основные методы анализа генетически модифицированных организмов приведены в табл.5.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *